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细菌检测

发布:2017-01-14 14:32      点击:

1.     单个细菌自发荧光的检测与定量

实验简介


细菌在可见光区的自发荧光会掩盖低拷贝荧光标记分子或者低丰度荧光蛋白所产生的微弱荧光信号,从而影响荧光显微镜成像和流式细胞仪检测。另一方面,自发荧光的检测也能够为细菌的鉴别提供一定的理论依据。细菌的自发荧光信号主要来源于细菌中氧化型的核黄素类物质(NADH、NADPH、FAD等),它们的最大吸收波长位于488 nm附近,发射光谱则与FITC荧光通道的滤光片相匹配。采用几种不同大小且FITC当量已知的荧光纳米颗粒绘制荧光强度和FITC当量的标准工作曲线,继而对单细菌水平的自发荧光进行定量。


仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道和FITC荧光通道。


实验结果

 
图1. 不同荧光当量荧光纳米颗粒的检测结果

 
 
图2. 八种不同细菌的自发荧光-散射二维散点图


表1. 单颗粒水平对细菌自发荧光进行定量
 

结果分析


1.      纳米流式检测装置可以检测到单个细菌的自发荧光信号,这些荧光信号主要来源于细菌中氧化型的核黄素类物质。

2.      结合单个细菌的散射光与荧光信号强度,发现细菌自发荧光的强弱与细菌的大小密切相关。

3.      利用三种FITC当量已知的商品化荧光纳米颗粒绘制FITC当量与荧光信号强度的标准工作曲线,对八种细菌的自发荧光分别进行了定量分析。

 Anal. Chem. 2012, 84, 1526-1532.


 

2.     单细菌低拷贝蛋白的高通量测定

实验简介


在细菌中,存在许多低拷贝的重要的蛋白和转录因子,发展高灵敏的检测分析方法对于低拷贝蛋白的检测具有重要意义。b-半乳糖苷酶是一种在原核和真核微生物体系中最成熟、常用的报告分子。传统的检测方法得到的是大量细菌中b-半乳糖苷酶表达及活性的平均效应,掩盖了细菌之间的表达差异。因此,在单个细菌水平考察b-半乳糖苷酶的表达更有利于了解基因表达的随机性、基因调控以及微生物的生理过程。采用b-半乳糖苷酶的亲脂性荧光底物C12FDG对细菌进行染色,结合荧光底物MUG显色和荧光分光光度计确定每个细菌中b-半乳糖苷酶的平均拷贝数,可将纳米流式检测仪检测得到的荧光统计分布直方图转化为b-半乳糖苷酶的拷贝数及其分布。


仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道和FITC荧光通道。


实验结果

 
图1. 单个细菌本底表达的b-半乳糖苷酶检测

 
图2. b-半乳糖苷酶的定量分析

表1. b-半乳糖苷酶的平均拷贝数伽马分布拟合的各项参数

*: Average number of b-gal molecules per cell is determined by the quantitative MUG fluorometric assay integrated with rapid bacterial enumeration on the HSFCM.
**: a and b are the two parameters characterizing the gamma distribution. The mean (n) and standard deviation (s ) of the protein number distribution are calculated from a and b.

结果分析


1.      利用纳米流式检测装置和亲脂性荧光底物C12FDG,在单细菌水平实现b-半乳糖苷酶的检测。

2.      根据检测得到的样品的荧光统计分布直方图和MUG定量得到的相同样品的酶的平均拷贝数,可将荧光的统计分布直方图转化为b-半乳糖苷酶的拷贝数的统计分布直方图,用伽马分布函数对直方图进行拟合,可获得b-半乳糖苷酶拷贝数的分布图。

Biosens. Bioelectron. 2013, 48, 49-56.


 

3.     基于b-内酰胺酶活性的耐药菌快速筛查

实验简介


近年来抗生素滥用导致细菌耐药日趋严重,已对人类健康构成严重的威胁。在多种细菌耐药机制中, b-内酰胺酶是引起80%病原菌耐药的主要原因,它能水解抗生素的核心结构,使抗生素失效。临床样本中存在耐药菌和敏感菌并存的情况,传统的检测手段难以检测少量耐药菌的存在。因此,发展快速、灵敏的单细胞水平b-内酰胺类耐药细菌的检测手段对于临床诊断和制定有效的治疗方案具有重要意义。b-内酰胺酶荧光底物LBRL1被b-内酰胺酶水解后,会释放出荧光残基,共价结合在耐药菌内的蛋白上,从而可利用纳米流式检测仪实现耐药菌的单细胞水平检测。


仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道和FITC荧光通道。


实验结果


 
图1. 纳米流式检测装置在单颗粒水平对革兰氏阴性菌的耐药性分析(样品经LBRL1标记,E. coli JM109 (绿),E. coli JM109/pUC19 (红),抑制剂作用后的E. coli JM109/pUC19 (蓝))


 
图2. 纳米流式检测装置在单颗科粒水平对革兰氏阳性菌的耐药性分析(未标记的B. cereus(绿),LBRL1标记的B. cereus(红),抑制剂作用后的B. cereus(蓝))

 
 
图3. 混合体系中耐药菌的定量分析

结果分析


1.      通过LBRL1荧光底物显色,纳米流式检测装置可以快速检测细菌内的b-内酰胺酶的活性,完成耐药菌的指认。

2.      快速检测抑制剂对b-内酰胺酶的抑制效果,为新型抑制剂的开发和筛选提供帮助。

3.      纳米流式检测装置可以测定混合体系中少量(低至5%)的耐药菌。

Chem. Eur. J. 2013, 19, 10903-10910.


 

4.     细菌感染及细菌耐药的临床诊断


实验简介


有研究指出,单个个体有可能被多重感染,即耐药菌与敏感菌可能同时并存于同一个病人体内。通常情况下,耐药菌并不是优势生长菌,但若没有及时被检出,一旦给药失误,敏感菌的增殖被抑制,原本低比例的耐药菌反而在体内菌群中占据优势,从而延误诊断与治疗,所以少量耐药菌的检测至关重要。通过荧光标记的抗体与核酸染料对细菌进行双染,建立基于超高灵敏流式检测技术的细菌耐药免疫荧光检测平台,实现混合样品中少量耐药菌(低至0.1%)的准确测定。此外,将该方法应用于临床尿液样本的检测,对耐药菌、敏感菌的生长状态进行了动态实时监测,为疾病的诊断和抗生素治疗方案的制订提供科学依据。
 

仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道、FITC荧光通道和APC荧光通道。


实验结果


 
 
图1. 动态观测抗生素对样本中耐药菌含量的影响
 
 
图2. 纳米流式检测装置对荧光双染的细菌样本(一种耐药菌和两种临床尿液样本)的分析

结果分析


1.      通过免疫荧光和核酸双染,纳米流式检测装置可以实现混合体系中少量耐药菌的检测。

2.      对抗生素作用下耐药菌、敏感菌的生长状态进行动态实时监测。

3.      实现临床尿液样本中耐药菌的快速、灵敏、特异的检测和定量分析。

4.      对于开展细菌耐药机理的研究具有重要的社会经济意义。
 

Biosen. Bioelectron. 2016, 80, 323-330.


 

5.     饮用水、茶饮中细菌总数的检测

实验简介


饮用水的安全对人类的健康至关重要,而饮用水中细菌的数量是直接反映水质的一个指标,因为细菌的数量在一定程度上反映了饮用水中病原菌数。目前,引用桶装水已相当普遍,而桶装饮用水在启封后至饮用完毕的一段时间内,其水质变化尤其是细菌数量的变化情况引起人们的关注。实际工作中经常以检验细菌菌落总数来间接判断水的卫生学质量,这种方法往往需要数天时间,且不能检测活的不可培养状态(Viable But Non-Culturable, VBNC)的细菌。使用核酸染料PicoGreen对细菌进行染色,非细菌的杂质颗粒由于没有核酸而无法被染色,能够在纳米流式检测仪上同时产生散射和荧光信号的颗粒则为细菌。纳米流式检测技术用于饮用水和茶饮中细菌的快速检测,不仅缩短了检测时间,而且能成功检测出活的非可培养状态的细菌。
 

仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道和FITC荧光通道。


实验结果

 
图1. 纳米流式检测装置对瓶装和桶装矿泉水中细菌的检测
 
 
图2. 纳米流式检测装置对茶饮中的细菌进行检测和计数
 

结果分析


1.      结合PicoGreen核酸染色,纳米流式检测装置可以对饮用水和茶饮中的细菌进行浓度计数,计数结果与传统的菌落计数法具有良好的一致性。

2.      与传统的基于细菌活性的菌落计数方法相比,纳米流式检测技术不仅缩短了检测时间,且成功检测出活的非可培养状态的细菌。

3.      该方法对于快速、实时监控饮用水质量,保证人类饮用水安全具有非常重要的指导作用。
 
 
 
 
 

Anal. Methods 2015, 7, 3072-3079.


 

6.     致病菌和总菌的绝对定量检测

实验简介


快速、灵敏、特异的致病菌检测分析对食品安全、环境监测、疾病诊断治疗和生物恐怖袭击的防范等具有重要意义。传统的病原微生物检测方法需要对细菌进行分离、培养及一系列生化反应,操作复杂、检测周期长,且无法适用于难以培养的病原菌,远不能满足实际需求。传统的流式细胞仪在致病菌的高灵敏检测方面仍然存在较大的局限性。使用Alexa Fluor 647-R-PE染料作为致病菌E. coli O157:H7单克隆抗体的荧光探针,使用荧光染料SYTO 9对细菌的核酸进行染色,在纳米流式检测装置上实现双荧光通道同时检测。致病菌在绿色和红色荧光检测通道能同时产生荧光信号,而只在绿色通道产生信号的为非致病菌。
 


仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道、FITC荧光通道和APC荧光通道。


实验结果

 
图1. 纳米流式检测装置对致病菌和总菌的同时分析


表1. 检测的致病菌比例与理论值的对比

 

 

结果分析


1.     结合免疫荧光和核酸共染法,纳米流式检测仪可以实现致病菌E. coli O157:H7与总菌数目的同时定量分析。对于含有不同配比致病菌E. coli O157:H7与非致病菌DH5a的混合样品的检测取得了与理论值非常一致的结果。

2.     在选择合适的抗体与染料探针的情况下,纳米流式检测仪在食品、环境、疾病相关样本中致病菌的快速鉴定与定量分析显示出巨大的应用前景。

 
Anal. Chem. 2010, 82, 1109-1116.

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