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病毒

发布:2017-01-14 14:41      点击:



1.     病毒的单颗粒水平无标记检测


实验简介


病毒是自然界中分布最广、个体数量最多的生命形式,同时它也是许多致死性疾病的罪魁祸首。历史上各种传染性病毒如流感病毒、天花、埃博拉病毒的肆虐给人类带来了巨大的灾难;动物病毒和植物病毒感染造成畜牧业和农业的巨额经济损失。另一方面,病毒具备良好的生物相容性和稳定性、生长繁殖迅速、容易大规模生产,且可以通过化学或基因工程的方法进行修饰,使其发挥特定的功能。病毒颗粒的物理化学性质对其功能有直接影响,因而发展快速、灵敏、通用的病毒颗粒表征方法对病毒技术的开发和推广至关重要。
然而,由于病毒纳米颗粒个体微小(直径主要分布在20-200 nm),结构简单,传统的流式细胞仪无法检测低于250 nm的颗粒,因而并不是检测病毒颗粒的最佳选择,目前尚没有一种技术能在单颗粒水平实现病毒纳米颗粒的无标记、快速、准确检测。纳米流式检测技术的发展为流式检测病毒颗粒开辟了蹊径。

仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为532 nm的激光器,检测通道为散射通道。


实验结果

 
图1.  纳米流式检测仪对轻小病毒MS2的无标记检测


结果分析


本实验中选取的病毒是粒径仅为27 nm的轻小病毒MS2,其结构为正二十面体,遗传物质为单链环状RNA。对MS2病毒检测的信噪比为11,表明纳米流式检测仪在辨别MS2病毒与背景噪声方面具备非常高的灵敏度,这个灵敏度能够满足自然界中绝大多数病毒纳米颗粒的检测需求。
 
 

2.     颗粒材质对于散射光的影响


实验简介


根据Mie散射理论,纳米颗粒的散射截面不仅与颗粒粒径有关,还受到颗粒与周围介质的相对折射率的影响。目前,许多测定病毒粒径的方法都选用聚苯乙烯微球作为粒径标准。然而聚苯乙烯微球的折射率(1.59~1.60)高于病毒等生物材料的折射率(1.40~1.47),这无疑会造成较大的粒径检测误差。根据病毒的结构组成,可以推测其折射率为~1.46,与二氧化硅的折射率(1.463)相近。选取粒径相似的T7噬菌体(头部直径60 nm)、二氧化硅纳米颗粒(60 nm)和聚苯乙烯微球(63 nm)来检验折射率对散射光强度的影响。

 

实验结果

 
图2.  不同材质相似粒径(60 nm)的纳米颗粒检测结果


结果分析

1.     纳米流式检测装置对三种纳米颗粒的鉴别能力很强,均得到很好的散射光峰面积直方图。

2.     二氧化硅纳米颗粒和T7噬菌体均为高度单分散性且均一的颗粒,散射光强度的变异系数很小,表明纳米流式检测仪测量颗粒信号具有很高的精确度。

3.     对比相同尺寸不同材质纳米颗粒的散射强度,结果表明T7(头部直径约为60 nm)和60 nm二氧化硅纳米颗粒的峰高和峰面积相近,可推测出二者具有相近的折射率,证明纳米流式检测仪能快速分析不同材质对颗粒散射光的影响。
 
 

Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 10239-10243.


 

3.     病毒混合物的粒径分辨


实验简介


病毒作为一种应用广泛的生物纳米颗粒,它的粒径在动态传递、疾病预防、传染病爆发及影响方面扮演了重要的角色。对病毒颗粒实现高分辨率和高通量的粒径分布甚至内部成分表征在病毒学研究、疾病诊断和治疗以及生物纳米技术应用中都非常必要。电子显微镜(透射电子显微镜和扫描电子显微镜)是在单颗粒水平对病毒纳米颗粒的形貌和粒径表征的经典方法,能够清晰地揭示出病毒纳米颗粒的微观结构。但是此方法存在样品制备繁琐、测量速度慢等不足,且难以提供具有统计代表性的量化信息。在此使用二氧化硅纳米颗粒作为病毒粒径测量的标准,将一系列粒径已知(经TEM表征)的二氧化硅纳米颗粒制成混合物,经纳米流式检测仪测量后,绘制散射光强度与颗粒粒径的标准工作曲线,即可将同等采样条件下病毒的散射光强度转换为颗粒粒径。
 

 

实验结果

 
图3. 纳米流式检测装置对四种病毒混合物的尺寸分辨和粒径表征


表1. 纳米流式检测装置粒径结果与传统方法的对比
 
EPD: The equivalent particle diameter of a sphere with a volume equivalent to the volume of a virus.

 

结果分析


1.      纳米流式检测装置的高分辨率能够根据散射光强度的差异从混合物中区分四种不同类型的噬菌体。

2.      以五种不同粒径的二氧化硅纳米颗粒作为标准绘制标准曲线,纳米流式检测仪能够实现不同病毒纳米颗粒的粒径的快速检测。相对于传统的透射电镜表征技术,该方法对病毒纳米颗粒悬液进行直接检测,将分析时间从数小时缩短至几分钟,统计精确性高,检测速率每分钟高达10000个颗粒。

3.      纳米流式检测装置测得的粒径与TEM测得的尺寸计算出来的等效球体直径非常一致。
 
 

 


 

4.     病毒样品的纯度测定和质量控制


实验简介


病毒产品制备过程中,每个批次病毒的纯度或病毒空壳的比例通常是人们关注的一个问题,利用纳米流式检测装置快速、高通量的优势,可以对病毒产品进行快速高通量表征和实时质量控制。 病毒衣壳因其卓越的生物相容性、均一的结构和容易改造等优点在纳米技术和纳米医药领域有着广泛的应用前景。此外,病毒将基因组传递到宿主细胞进行自我复制的过程对于研究药物释放机理大有裨益。以T7噬菌体为例,将NaClO4作用于噬菌体,诱导其基因组释放,利用纳米流式检测装置在单颗粒水平进行动态监测,同时考察NaClO4作用浓度对噬菌体基因组释放的影响。
 

 

实验结果


          
  图4. 不同批次T7噬菌体的粗提混合物与纯品的对比


   
    
 图5. 不同浓度的高氯酸钠对T7噬菌体的基因组释放的影响
 
 

结果分析


1.      通过散射光强度的差异分辨粗提混合物中成熟病毒和不成熟病毒颗粒及杂质颗粒的信号,对病毒粗提混合物进行实时的纯度表征。

2.      通过散射光强度的差异分辨完整噬菌体和基因组释放后的蛋白空壳的信号。

3.      在单颗粒水平对DNA释放的动态过程进行实时监控,通过优化高氯酸钠作用的浓度,可以提高蛋白空壳的产率。

4.      纳米流式检测装置为病毒产品如疫苗或病毒纳米颗粒元件的研发和质量控制提供先进的表征手段。

5.     纳米流式检测技术具备卓越的分辨率,能够区分粗提混合物中不成熟病毒颗粒的散射光信号(~1100 counts)和基因组释放后蛋白空壳的散射光信号(~600 counts)的微小差异,这对于病毒结构学的研究将大有裨益。


Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 10239-10243.