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纳米流式检测仪原理及应用

发布:2017-01-16 12:23      点击:

纳米流式检测仪的面世使得纳米颗粒的分析亦能享有传统流式检测快速、多参数、数据可靠、统计精确性高等诸多特点。纳米流式检测仪在生物医药、环境检测、食品安全、能源材料等领域均具有广阔的应用前景。
1、主要技术原理及路线
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种对悬液中的细胞或细胞大小的颗粒进行快速定量分析和分选的先进技术。其特点是:1)快速,最高每秒可分析或分选数万个细胞;2)多参数,能实现细胞大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、金属离子等物理、化学、及生化性质的多参数同时测定;3)在短时间内得到大量数据,获得细胞性状的统计分布图,获得参数间大量的相关信息。然而,由于检测灵敏度的局限性,传统的流式细胞仪难以检测荧光强度小于几百个荧光素分子或尺寸小于0.5微米的细胞或颗粒,使得其在细胞的微弱信号检测和纳米颗粒表征等领域的应用受到极大的限制。厦门大学颜晓梅教授课题组首次将瑞利光散射技术融入鞘流单分子荧光检测技术,通过减小探测区体积至飞升级(femtoliter)以及延长纳米颗粒穿越激光探测区的时间至毫秒(milliseconds)等措施有效地降低背景信号和增强发射光子数,使流式检测技术的检测灵敏度大幅度提升,创建单颗粒水平多参数定量表征新技术-超高灵敏流式检测技术,实现了单个低折射率纳米颗粒的散射检测灵敏度达到前所未有的24 nm(较传统流式细胞仪至少提升5个数量级),实现了纳米颗粒的多参数同时表征,检测速率高达每秒钟上百次。快速获得粒径及生物化学性状的分布特征,不仅具有高度的统计代表性,通过对单个纳米粒子散射和多色荧光的同时检测,而且可实现参数之间的相关分析,对纳米生物样本的粒径及其分布、颗粒浓度、以及携载化学或基因药物、表面偶联的靶向探针分子的数量及其分布等性状进行快速的多参数同时定量表征。
 


2、应用案例

1)建立了高分辨的纳米颗粒粒径分布快速表征技术
电子显微镜(透射电镜和扫描电镜)是纳米颗粒粒径和形貌表征的首要方法,但是存在样品制备繁琐、测量速度慢、尤其是粒径分布统计存在一定的主观性并且因为统计个数偏少(100-200 个)而缺乏代表性等不足。动态光散射技术(dynamic light scattering, DLS)虽然能够快速、准确地测定纳米颗粒悬液的平均粒径,但是这种集权平均的检测技术分辨率较低,不适用于混合样或者多分散样品的检测,灰尘或杂质颗粒存在时容易出现较大的偏差。超高灵敏流式检测技术通过对单个纳米颗粒散射光强度的测定实现其颗粒粒径的表征,可以在1 分钟的时间内对几千个纳米颗粒的散射光强度进行逐一测定,借助同样材质的粒径标准球,实现纳米颗粒粒径分布的高分辨表征(对于二氧化硅纳米颗粒,分辨率为~5 nm),仅需2-3 分钟就可获得透射电镜需要数小时才能得到测试结果,而且更具统计代表性。


图3. 透射电镜、动态光散射和超超高灵敏流式的纳米硅球粒径表征结果


2)发展了基于单颗粒计数的纳米颗粒浓度测定方法
纳米颗粒浓度的准确测定是纳米科技发展的一个重要保障,而对于形状不规则、粒径不均一的复合或杂化纳米粒子,目前国际上还没有一种切实可行的颗粒浓度准确测定方法。基于单颗粒计数,我们发展了纳米颗粒浓度的无标样绝对定量和荧光纳米微球内标定量两种方法,具有快速(2-3 分钟)、简便(悬液检测)、灵敏(10 微升fM-pM 的颗粒样本)、不受限于颗粒形状的规则性、无需了解颗粒的材质密度等优点,解决了形状不规则、复合、杂化纳米粒子的浓度难以准确测定的问题(J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 12176-12178)。目前已实现聚苯乙烯纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、聚吡咯/二氧化硅复合纳米粒子、纳米金、纳米银、病毒、细菌以及阿霉素脂质体、siRNA-脂质纳米粒等颗粒浓度的准确测定。

3)建立了纳米载药系统的多参数定量表征新技术
在纳米颗粒粒径及其分布、颗粒浓度快速表征的基础上,在纳米流式检测平台上建立了纳米载药系统的功能分子(如表面偶联靶向分子探针分子,携载的化学药物、基因药物)的定量表征方法,将为生物医学研究和纳米药物研发提供独特的单颗粒水平多参数定量征技术。

4)生物纳米颗粒分析
纳米流式检测仪可以用于天然生物纳米颗粒(细胞外囊泡、病毒、细菌、亚细胞结构)的定量和定性分析。传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞,散射光的检测极限通常是300-500nm,很难对细胞外囊泡、病毒、细菌、亚细胞结构进行精确地定量和定性分析。而纳米流式检测仪突破了传统流式细胞仪的检测极限,散射光可以测到24 nm 纳米低折射率纳米颗粒,完全可以满足这些天然生物纳米颗粒的检测需求。


 

生命科学研究
 

 

线粒体分析
线粒体是细胞的能量工厂,在真核细胞的进化中发挥着重要作用。此外,线粒体还与细胞内信号转导密切相关,如自噬、细胞死亡、自然免疫等。多种复杂的人类疾病都是由线粒体的功能异常导致的,包括神经退行性疾病和新陈代谢紊乱。因此,线粒体研究对于基础生命科学研究意义重大。线粒体的结构微小,且不同线粒体之间存在较大的异质性(heterogenity),它的直径一般为0.5-1.0 μm,长度为1.5-3.0 μm。散射光强度与100-200 nm聚苯乙烯微球相当,与其功能相关的生化物质含量较低,单个线粒体水平上的检测一直以来都是一个富有挑战性的课题。迄今为止,流式分析仍然在单个线粒体的分析领域占据主导地位,已经有相关的研究采用流式细胞仪对线粒体的纯度、膜电位的微小变化、钙离子诱导后的形态变化,活性氧(ROS)等进行了检测。遗憾的是,这些工作往往局限于对较强的荧光信号的分析。传统流式细胞仪因灵敏度的缺乏在单个线粒体的分析检测方面仍然受到很大的限制。纳米流式检测仪灵敏度大幅提升,可以广泛应用于单线粒体分析。
 
囊泡分析
2013年的诺贝尔生理学或医学奖授予了发现并阐释细胞囊泡运输系统及其调控机制的三位科学家,囊泡运输系统作为细胞的基本组成,已成为国际研究热点。细胞外囊泡(Extracellular Vesicles)主要由微泡(Microvesicles)和外泌体(Exosomes)组成,微泡是通过细胞膜包裹信号分子而直接释放,直径约为100-1000 nm;外泌体则是由细胞内的多泡小体与细胞膜融合后而释放,直径约为30-120nm。囊泡运输系统参与生命活动的各个方面,研究发现extracellular vesicles广泛存在于人体的血液、乳汁、尿液以及唾液等体液中,其种类和数量与机体的生理状态息息相关。细胞外囊泡有望成为新型的疾病诊断标志物、纳米药物载体、以及治疗试剂和药物作用靶标,从而在疾病的诊断和治疗领域具有巨大的应用前景。目前细胞外囊泡的检测方法主要有电子显微镜、纳米微粒追踪分析术(NTA)和流式细胞仪等,流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量,而且通过荧光标记可以检测囊泡的来源,将囊泡进行分类,因此,流式细胞仪是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。然而,传统流式细胞仪灵敏度不足以对胞外囊泡进行精确地定量和定性分析。纳米流式检测仪是是目前市场上唯一检测范围可以完全包容囊泡的流式检测仪。
 
病毒表征
病毒是一类由核酸和蛋白质构成的非细胞形态的微小有机体,直径主要分布在20-200 nm。病毒颗粒具有许多能够用于纳米生物学和纳米医学的天然特征,迄今为止,还没有一种人工合成的纳米颗粒具有可与之媲美的完美对称性与实用性。如今,基于病毒纳米颗粒及其材料学性质的相关应用存在着前所未有的机遇。此外,病毒分析在基础生命科学研究、公共卫生防护、生物医药技术和环境监测等方面具有重大需求,迫切需要发展一种先进的高分辨率、高通量的检测手段对病毒或病毒样颗粒的种类、粒径和内部组成等进行表征。纳米流式检测仪可通过对单个病毒粒子散射光强度的测定可以实现了不同类型病毒颗粒的尺寸分辨、病毒不同组分的高通量检测、动态监测病毒DNA释放的过程;此外,借助核酸染色和散射、荧光双参数检测,在单颗粒水平实现了完整病毒颗粒、病毒空壳和游离病毒核酸的快速鉴定,将为纳米药物和疫苗研发提供先进的表征手段。
 
细菌检测
细菌对环境,人类和动物既有用处又有危害。一些细菌成为病原体,导致了破伤风、伤寒、肺炎、梅毒、霍乱和肺结核。在植物中,细菌导致叶斑病、火疫病和萎蔫。细菌也对人类活动有很大的影响。例如奶酪及优格的制作、部分抗生素的制造、废水的处理等,都与细菌有关。在生物科技领域中,细菌也有着广泛的运用。细菌检测对于医疗健康、食品安全、生物科技等方面具有举足轻重的作用。细菌粒径较小,内部结构简单,自身表达的生物分子数目较低(如低丰度的膜蛋白表达),无法标记足够多的荧光探针,因此,它们产生的散射光和荧光信号都较弱,导致传统的流式细胞仪在细菌的高灵敏检测方面存在较大的局限。传统流式细胞仪的信号采集模式一般利用前向散射光的信号触发侧向散射光和荧光信号的采集,样品颗粒需要大于0.5 m才能与背景信号有效区分,然而相当一部分的细菌的粒径小于这个尺寸。其次,传统流式细胞仪的荧光检测限较高,难以对细菌产生的微弱荧光信号进行准确检测。纳米流式检测仪已经在细菌检测有诸多应用案例。
 

 
纳米药物研发与质量控制

 



临床抗肿瘤药物阿霉素脂质体的表征:阿霉素脂质体(Doxil)是FDA批准的第一个纳米药物,阿霉素脂质体的粒径分布和单个颗粒包裹的阿霉素含量的表征需要使用冷冻透射电镜和复杂的三维断层扫描重构技术,花费2-3 天的功夫。使用用纳米流式检测仪对阿霉素脂质体悬液进行测定,借助粒径标准球和荧光标准球,仅需2-3 分钟的时间即实现了阿霉素脂质体粒径和阿霉素含量(分子数)分布的定量表征,而且可在单颗粒水平进行粒径和包裹阿霉素含量的相关分析。
siRNA-脂质纳米粒的表征:携载siRNA 的脂质纳米粒是目前临床证实最具潜力的RNA 干扰药物,已进入II 期临床试验。但是纳米药物的颗粒浓度和装载siRNA 的脂质纳米粒比率这两项指标目前尚缺乏有效的表征手段,即便采用价格极其昂贵的冷冻透射电镜仍然无法确认纳米颗粒是否装载了siRNA,而采用纳米流式检测仪 1-2 min既可以得到核酸纳米药物的颗粒浓度和载药率。

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